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    公开号:WO1987001459A1
    申请号:PCT/DE1986/000394
    申请日:1986-08-28
    公开日:1987-03-12
    发明作者:Hermann J. Wolter
    申请人:Wolter Hermann J；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur Herstellung von reinen Rezeptoren und/oder Liganden und/oder Antikörpern, danach hergestellte Materialien sowie deren Verwendung
    [0002] Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von nativen Rezeptoren und/oder Liganden und an diese bindende Liganden-Antikörpern, die Verwendung der hergestellten reinen Liganden, Rezeptoren oder Liganden-Antikörper sowie Liganden, Rezeptoren und Antikörper.
    [0003] Die Herstellung reiner, nativer Rezeptoren aus diesen enthaltenden Materialien, wie bspw. Geweben, Zellen und Zellbestandteilen, also biologischem Material sowie von nativen, bindungsfähigen Liganden für derartige Rezeptoren ist für die Untersuchung biologischer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen sowie für den therapeutischen Ersatz von Liganden bzw. das Eingreifen in diese außerordentlich wichtig, und besitzt auch für die Herstellung von Arzneimitteln (Liganden sind bspw. Peptid-Hormone o.dgl., können aber auch körperfremde Materialien, wie Viren, Chemotherapeutika o.dgl. sein) große Bedeutung. Ebenso sind Ligandenantikörper, die native Liganden selektiv erkennen und binden, für die Untersuchung von und das Eingreifen in Liganden/Rezeptor-Wechselwirkungen sehr wichtig.
    [0004] Eine Untersuchung der Rezeptor/Ligandenwechselwirkungen bzw eine Darstellung von Teilbereichen des Rezeptors oder auch Untersuchung von nativen Gruppen desselben ist nur möglich, wenn sicher biologisch bindungsfähige, intakte Rezeptoren vorliegen. Bisher wurden Rezeptoren aus biologischem Material dadurch gewonnen, indem ein an ein Trägermaterial wie Sephadex o.dgl. gebundener Ligand mit dem rezeptorhaltigen Material in Kontakt gebracht wurde und nach Inkubation mit diesem die an die immobilisierten Liganden gebundenen spezifischen Rezeptoren aus dem Gemisch isoliert wurden. Dabei können die immobilisierten Liganden bspw. in Säulen vorgelegt werden, durch die das biologische Material läuft. Die Abtrennung der Rezeptoren von den an Trägermaterial gebundene Liganden erfolgte sodann durch Inkubation mit einem Puffer, der zur Dissoziation der Rezeptoren von den Liganden führte (Fujicka, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comrnun., Vol. 131 (1985), S. 640-646).
    [0005] Das bisherige Verfahren war insofern nachteilig, als ein bereits modifizierter Ligand eingesetzt wurde, von dem man nicht genau wußte, ob er an seinen Rezeptor mit der gleichen Spezifität und Sensitigität bindet, wie der native Ligand. Durch seine Anbindung an das Trägermaterial ist der modifizierte Ligand strukturell zusätzlich verändert, so daß nicht mit Sicherheit gesagt werden kann, ob er in dieser veränderten Form überhaupt an den erwünschten Rezeptor bindet oder ob er eine andere Binoungsstelle besetzt. Die nach dem Stand der Technik hergestellten Rezeptoren waren somit zwangsweise stets mit Veränderungen im Molekül behaftet. Die Untersuchung und Strukturaufklärung von Peptidliganden erfolgte bisher ausschließlich durch Verwendung von Peptidliganden, die durch chromatographische Methoden aus biologischen Materialien isoliert wurden und die nach ihrer Synthese unter verschiedenen Konformationsänderungen auf ihre Rezeptorbindungsfähigkeit getestet wurden. Diese Methoden erlauben jedoch keine hinreichenden Aussagen hinsichtlich der Erfordernisse für eine optimale Rezeptorbindung des Liganden, um peptiderge Liganden und Ligandanaloga herstellen zu können, die in ihrer Rezeptorbindungsfähigkeit weitgehend dem des nativen rezeptorgebundenen Liganden entsprechen, ist es notwendig, den nativen, ehemals rezeptorgebundenen Liganden rein und bioaktiv darzustellen, um seine Konformationsparameter (3-dimensionale Konformation, Acetylierung, Sulfatierung), die für die Bindungsfähigkeiten an seinen spezifischen Rezeptor außerordentlich wichtig sind, Destimmen zu können.
    [0006] Die Isolierung und Reindarstellung von spezifischen Ligana-antikörpern erfolgte bisher durch
    [0007] Affinitätschromatographie, wobei der Ligand an ein
    [0008] Trägermaterial gebunden wird und das
    [0009] Ligancenantikörper-haltige Serum damit inkubiert wird. Die restlichen Serumbestandteile werden durch Waschen des immobilisierten Antikörμer-Ligand-Liganden-Antikörper¬
    [0010] Komplexes entfernt. Danach werden die ligandgebundenen
    [0011] Ligandenantikörper vom Liganden durch Elution abgelöst. Da bei der Bindung des Liganden an das Trägermaterial dessen Bindungsfähigkeit und Spezifität zu seinem spezifischen Antikörper vermindert sein kann und auch Liganden-Antikörper gebunden werden können, die ihren nativen oder sythetischen Liganden nur vermindert binden (bspw. sind die Konformitätsparameter des nativen Peptidliganden, die für die Antikörpererkennung und -bindung von Wichtigkeit sein können, nicht hinreichend berücksichtigbar, da sie nicht hinreichend bekannt sind).
    [0012] Die nach dem Verfahren nach dem Stand der Technik hergestellten Rezeptoren und Liganden waren somit zwangsweise stets mit Veränderungen im Molekül behaftet.
    [0013] Es ist daher Aufgabe der Erfindung, reine Liganden und
    [0014] Rezeptoren sowie Antikörper für diese herzustellen, welche erstmals Untersuchungen an nativem Material ermöglichen.
    [0015] Die Aufgaoe wird erfindungsgemäß durch die im Kennzeichen des Patentanspruches 1 aufgeführten Merkmale gelöst.
    [0016] Ein weiteres vorteilhaftes erfincungsgemäßes Verfahren ist durch die im Kennzeichen des Patentanspruches 2 aufgeführten Merkmale charakterisiert. Dabei wird hier unter "Antikörper II" Material verstanden, das zur Bindung an den Ligandenantikörper befähigt ist, es fallen also auch Substanzen wie Protein A oder Protein G darunter.
    [0017] Prinzipiell werden erfindungsgemäß zunächst
    [0018] Liganden/Rezeptor-Komplexe hergestellt, die mit einem Liganden-Antikörper verknüpften Trägermaterial inkubiert werden. Dadurch werden Rezeptoren, die keine Bindungsstellen für den Liganden aufweisen, aus dem Gemisch entfernt. Die ligandgebundenen Rezeptoren werden danach mit einem
    [0019] Dissoziationspuffer von ihren Liganden abgelöst und durch Dialyse vom restlichen Material getrennt. Dadurch ist es erstmals möglich, nur bioaktive Rezeptoren zu erhalten, die vorher mit nicht-modifizierten Liganden bindungsfähig waren.
    [0020] Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von bincungsfähigen Liganden umfaßt die Inkubation von solubilisierten Zellmembranen, an deren Rezeptoren der native Ligand gebunden ist, mit einem Liganden-Antikörper verknüpften Trägermaterial und das Entfernen von nicht-bindenden Rezeptoren durch Waschen. Die Inkubation und das Waschen erfolgt mit einem Antikörperbindungspuffer. Die Ablösung des Rezeptors von seinem nativen Liganden erfolgt durch Inkubation mit einem Dissoziationspuffer. Der native Ligand wird jetzt durch Elution von seinem Antikörper getrennt und durch Dialyse oder Molekularexklusionschromatographie vom restlichen Material getrennt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ligandenantikörpern beinhaltet in einer bevorzugten Ausgestaltung die Verbindung erfindungsgemäß rein dargestellter Rezeptoren, die bereits mit ihren spezifischen Liganden verbunden sein können, mit einem Trägermaterial und nachfolgend mit einem spezifischen Liganden, der nativ oder synthetisch sein kann. Dieser Komplex wird mit Sera, die Ligandenantikörper enthalten und in herkömmlicher Weise gewonnen wurden inkubiert. Hierbei ergibt sich ein stabiler Trägermaterial-Rezeptor-Ligand-Liganden-Antikörper-Komplexes entfernt werden. Anschließend wird der spezifische Ligandenantikörper in an sich bekannter Weise von seinem rezeptorgebundenen Liganden durch Elution mit einem Puffer getrennt und der Antikörper mit koeluierten Liganden bspw. durch Molekularexklusionschromatographie oder Dialyse oder ähnlicne geeignete Verfahren, wie jedem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig, getrennt.
    [0021] Dabei kann es vor Durchführung de r oben beschriebenen Verfahrensscnritte empfehlenswert sein, die Rezeptoren im biologischen Material dadurch anzureichern, indem das biologische Material vorher mit einem Elutions- oder Dissoziationspuffer inkubiert wird, um dadurch eine Ablösung des nativen, rezeptorgebundenen Liganden zu erreichen. Der Abgelöste Ligand kann durch Dialyse oder Zentrifugation von den Rezeptoren getrennt werden. Es kann aus dem biologischen Material auch die Entfernung von Ligandenbindungsstellen mit anderen Bindungskonstanten als den Rezeptoren, wie Materialien, die den Liganden sytheti sieren, transportieren und/oder lagern, erzielt werden. Dabei wird das biologische Material mit Ligandenantikörper- verknüpftem Trägermaterial inkubiert.
    [0022] Die ligandenbindungsfähigen Materialien mit einer größeren Bindefähigkeit am Liganden als der Rezeptor wenden an die immobilisierten Liganden-Antikörper gebunden und die ligandenfreien Rezeptoren, deren nativer Ligand durch Behandlung mit einem Dissoziations- oder Elutionspuffer abgelöst wurde, bleiben in Lösung. Dieses ligandenfreie Rezeptoren aufweisende Material kann dann einem der erfindungsgemäßen weiteren Verfahren unterworfen werden.
    [0023] Die Rezeptor-Ligand-Bindungen können in bekannter Weise durch cnemische Kreuzvernetzung ( "crosslinking", S. Brenner, V.B. et al., Cell Vol. 40 (1985), S. 183-190) stabilisiert werden. Die Verknüpfung kann dabei zwischen primären und sekundären aliphatisehen Aminen auf Seiten von Rezeptor und Liganden stattfinden (Tesser, G.I. et al. Hoppe. Seyler's Z. Physiol. Chem. Vol. 355 (1975) S. 1624-1629). Die Verwendung von Dithiobis(succinimidyl)-propionat (DSP; "cross-linker") das eine innere reduzierbare Disulfidbindung besitzt, kann eine stabile Rezeptor-Liganden-Bindung erreicht werden, die unter Reduktionsbedingungen (bspw. Dithiothreitoi oder Mercaptoethanol) wieder spaltbar ist. Allerdings werden durch die Inkubation mit den Reduktionsmitteln bekanntlich auch Disulfidbindungen im Rezeptormolekül und Ligandenmolekül gespalten, was eine Beeinträchtigung der Bioaktivität des Rezeptors bzw. Liganden bewirken kann, falls diese für dessen Funktion essentiell sind.
    [0024] Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung derartiger reiner Liganden, Rezeptoren oder Liganden; so können bspw. die erfindungsgemäßen Rezeptoren zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Rezeptorantikörpern für die Isolierung und Identifizierung von Rezeptor-cDNA-Klonen aus Klongemischen ("clone immunoprecipitated probes") wie bspw. zur Isolierung und Identifizierung von menschlichen Glukokortikoid- und Östrogeήrezeptoren (Weinberger, D. et al., Science, Vol. 228 (1985), S. 740-742 bzw. Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 82 (1985), S. 7889-7893) durch Bildung eines Klon-Rezeptor-Antikörper-Protein-ASepharose-4B-Komplexes. Die Rezeptor-Klone können jedoch auch durch Bildung eines erfindungsgemäßen Klon-Ligand-Ligandenanti körper-Sepharose-4B-Komplexes als solcher - wobei auch die erfi nαungsgemäßen Liganden und Ligandenantikörper verwendet werden können - isoliert und charakterisiert. Diese Komplexbildung zur Klonisolierung ist bisher unbekannt. Außerdem können die erfindungsgemäßen Liganden-Antikörper zur Isolierung und Charakterisierung von Ligand-cDNA-Klonen durch Bildung eines Klon-Ligandenantikörper-Protein-A-Sepharose-4BKomplexes (Young T.A.et al., Science, Vol. 222 (1983), S. 86-88; Mayo, K.E. et al. Nature, Vol. 306 (1983) S. 86-88; Helfman, D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 8o (1983), S. 31-35) verwendet werden.
    [0025] Die erfindungsgemäßen Rezeptoren, Liganden und Ligandenantikörper können auch zur Unterscheidung von normalem und patnologisch verändertem biologischem Material durch herkömmliche Methoden (RIA) oder immunhi stochemi sehe Verfahren u.dgl. eingesetzt werden, wobei durch die erfindungsgemäßen reinen bioaktiven nativen Substanzen erstmals eine sehr hohe Spezifitat und Sensitivität besteht.
    [0026] Es können auch spezifische Ligandenbindungsstellen an Rezeptoren und Liganden bestimmt werden und poly- oder monoklonale Antikörper gegen diese Ligand- oder Rezeμtorbindungsstellen hergestellt werden.
    [0027] Mit Hilfe der erfindungsgemäßen reinen, bioaktiven, nativen
    [0028] Rezeptoren, Liganden und Ligandenantikörper kann eine einfachere und zuverlässigere Aufklärung von Wirkungsmechanismen synthetischer oder natürlicher Wirkstoffe und deren Derivate erfolgen (bspw. Tests für die
    [0029] Bindungsfähigkeit verschiedener Liganden durch Rezeptorblockade über spezifische Rezeptorantikörper). Es können spezifische Zellpopulationen, auch bspw. eine bestimmte Gruppe von T-Lymphozyten über fluorescence activated cell sorter (FACS) oder Immunpräzipitierung (Brenner, M.B. et al, Nature Vol. 322 (1986), S. 145-149) über die Verwendung von spezifischen Rezeptorantikörpern, die durch Verwendung von erfindungsgemäßen Rezeptoren hergestellt werden, isoliert werden. Außerdem können mit Hilfe von erfindungsgemäßen Liganden und Ligandenantikörpern, die markiert sind, FACS und Immunpräzipitierungsanalysen durchgeführt werden.
    [0030] Selbstverständlich erstreckt sich die Erfindung auch auf Arzneimittel, die erfindungsgemäß hergestellte Rezeptoren, Liganden oder Ligandenantikörper sind, bspw. poly- oder monoklonale Antikörper gegen erfindungsgemäße Rezeptoren, Rezeptorbindungsstellen oder Ligandenbindungsstellen (bspw zur Blockierung von Rezeptoren an Zelloberflächen).
    [0031] Ferner kann durch erfindungsgemäß hergestellte Substanzen die Strukturaufklärung von Peptidliganden erfolgen. Bisher wurden Peptidliganden chromatographisch aus biologischen Materialien isoliert und nachsynthetisiert, nach der Synthese wurden sie auf verschiedene Konformationsänderungen und Rezeptorbindungsverhalten getestet.
    [0032] Vorteilhafte Weiterbildungen der in den Ansprüchen aufgeführten Merkmale ergeben sich aus den Unteransprüchen. In den hier vorl iegenden Unterl agen wird unter "Antikörper II" jedes Material verstanden, das spezifisch an "Antikörper I", den Liganden-Antikörper, bindet, also auch Proteine wie Protein A oder Protein G.
    [0033] Dadurch, daß erstmals nicht veränderte Rezeptoren und unveränderte Liganden erst aneinander gebunden werden, und nur Rezeptoren/Liganden isoliert werden, die sicher vor ihre Isolierung mit einem Rezeptor verbunden waren, kann ausgeschlossen werden, daß Liganden oder Rezeptoren, die nicht bindungsfähig waren, isoliert werden.
    [0034] Durch die Herstellung der reinen Rezeptoren ergibt sich eine Fülle von Möglichkeiten, bspw. synthetische Liganden zu untersuchen; durch die Herstellung nativer Liganden das Vorhandensein von Rezeptorstellen zu untersuchen.
    [0035] Wacnfolgend wird cie Erfindung anhand von Beispielen sowie der begleitenden Zeicnnung näher erläutert, in der zeigt:
    [0036] Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfincungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung nativen Rezeptors, Figur 2 die schematische Darstellung einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von bindungsfähigen Liganden,
    [0037] Figur 3 eine weitere bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von Ligandenantikörpern (I), und
    [0038] Figur 4 einen Vorreinigungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens für das
    [0039] Ausgangsmaterial.
    [0040] Die Erfindung wird nachfolgend am Beispiel des Rezeptor/Ligand Systems von Dynorphin-Dynorphinrezeptor, insbesondere des Bereiches des Octapeptid-Fragments Dynorphin-A-1-8
    [0041] (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile) - im folgenden abgekürzt als DA8 - näher erläutert. Dynorphin ist ein opioides Peptid mit 17 Aminsäuren, dessen Rezeptoren im zentralen und peripheren Nervensystem weitverbreitet sind. DA8 besitzt keine inneren Disulfidbindungen. Der Dynorphin-1-8-Rezeptor ist ein
    [0042] Opiat-Rezeptor (s. Corbett, A.D. et al., Nature, Vol. 299, (1982) S. 79f f.).
    [0043] Wie bereits oben erläutert, ist die Erfindung aber auch auf andere, dem Fachmann geläufige Ligand/Rezeptorsysteme anwendbar, wie cDNA/mRNA; Virus/Zelloberflächen etc. und keinesfalls auf diese Anwendung brgrenzt. Beispiel 1
    [0044] Herstellung von trägergebundenen Rezeptoren oder Antikörpern:
    [0045] 2g aktivierte Sepharose 4B wurde als Trägermaterial in 15 ml ImM Salzsäure 15 Minuten gequollen, über einem gesinterten Glasfilter mit 500 ml 1mM HCl (mit 50ml-Mengen) gewaschen und anschließend mit 50 ml Kupplungspuffer (50 ml 0.1 M Natri urnb icarbonat (pH8.0), 0.5 M NaCl ) gewaschen. Anschließend sofort 12 ml Kupplungspuffer mit 5mg des anzukuppelnden Peptiαs (bspw. DA8-Antikörper, DA8-Rezeρtoren oder Schweine-Anti-Kaninchenimrnunglobulin-Antikörper) dem Gel zugeben und für 2 St. bei 20 Grad C. inkubiert; der Kupplungspuffer entfernt und die Reaktion mit 15 ml 0.2 M Glyzin (pH 8.0) über 2 h bei 20 Grad C gestoppt; anschließend wurde das derart mit einem angekoppelten Peptid versehene Gel in eine 10 x 0.7 cm Econo-Säule (BIORAD-Laboratories, Ricnmonc, USA) übertragen, bei 20 Grad C drei Mal mit Kupplungspuffer - alternierend mit 0.1 M Natriumacetat pH 4.0 unc 0.5 M uaCl gewesenen und cas Gel bei 4 Grad C in 50 mM TRIS-HCl pH 5 ,7 mit 0.05 Gew. /Vol. % Natriumazid aufbewahrt.
    [0046] Beispiel 2
    [0047] Peptidelution
    [0048] 2 ml des Gels wurden in eine 10 x 0.7 cm-Säule gegossen, mit
    [0049] 50 ml eines Tris Puffers (50 mM TRIS-HCl , pH 7.6, 1 Vol.% Triton X -100) gewaschen, 2 mg Peptid (DA8-verknüpfte DA8-Rezeptoren oder Dynorphin-A ( 1-8)-Antikörper) in 5 ml 0.1M Natriumbikarbonat (pH 8.0) und 0.5 M NaCl auf Säule aufgetragen und unter Rezirkulation über 16 h bei 4 Grad C inkubiert (Durcnflußrate: 6 - 7 ml / St.) ; das Eluat wurde gesammelt und Säule mit 40 ml einer Pufferlösung (50 mM TRIS-HCl , pH 7.6 mit 0.5 M NaCl , 0.1 Vol.% Triton X-100 und 1 mM PMSF) gewaschen, das Peptid mit 40 ml eines Elutionspuffers A (0.1 M Glycin-HCl , pH 5.0, mit 1.5 Mol NaCl , 0.1 mMol PMSF, 0.2 Vol.% Triton X-100, 10 ug/ml Leupeptin und 20 ug/ml Aprotinin für DA8-Rezeρtoren) oder eines Elutionspuffers B (0.1M Glycin-HCl , pH 2 ,5, mit 0.1 mM PSF und 0.2 Vol.% Triton X-100 für DA8-Anti kör per) eluiert und das Eluat in 0.5 ml-Fraktionen in 0.01 M Phosphatpuffer (pH 7.4 bei Elutionspuffer A und pH 8.3 bei Elutionspuffer B neutralisiert; Neutralisationspuffer).
    [0050] Beispiel 3
    [0051] Herstellung von nativen DA8-Liganden und DA8-Rezeptoren Slubilisierte Zellmembranen., herstellbar wie von Stephenson, F.A. et al. in Eur. J. Biochem. 123 (182), S. 291-298 beschrieben, die kein rezeptorgebundenes DA8 enthalten, werden 2 Std. bei 20 Grad C. mit einem Ligandenbindungspuffer (50mM TRIS-HCl , ph 7.6, das 5 mMol Mg2+, 5mMol EGTA und 1 mMol
    [0052] Synthetisches Schweine-DA8 enthält) inkubiert. Danach werden die DA8-Rezeptoren in einem Antikörperbindungspuffer (0.1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0 mit 0.5 NaCl und 0.2 Vol.% Triton-X-100) gelöst und mit DA8-Antikörper- verknüpfte Sepharose-4B 16 Std. bei 4 Grad Celsius inkubiert. Danach werden die DA8-Rezeptoren durch Inkubation (30 min bei 20 Grad Celsius) mit einem Dissoziierungspuffer (50mM TRIS-HCl , pH 7.5, mit 5 uMol synthetischem Schweine-DA8, 5 mM Mg2+, 5 mM EGTA und 5 uMol 5'-Guanylylimido-Diphosphat (Gpp(NH)p) vom synthetischen DA8 getrennt. Der jetzt freie DA8-Rezeptor kann jetzt durch Dialyse vom restlichen Material getrehnt werden.
    [0053] DA8-gebundene DA8-Rezeptoren können auch zuerst mit freien D A8 - Antikörpern (1 :100 verdünnt mit einem Antikörperbindungspuffer - 0.1M Natriumbicarbonat, pH 8.0, mit 0.5 M NaCl und 0.2 Vol.% Triton X -100) für 15 Std. bei 4 Grad C inkubiert und die DA8-gebundenen DAG-Antikörper vorn restlichen Material durch Dialyse getrennt werden (s. Figur 1 der Zeic nung). Nachfolgend wird dieser Rezeptor-Ligand-Ligandantikörper¬
    [0054] Komplex mit Schweine-Anti-Kaninchenimmunglobulin-Antikörper inkubiert, die mit Sepharose-4B verbunden wurden (s. Bsp. 1). An Stelle von Schweine-Anti-Kaninchenimmunglobulin-AntikörperSepharose 4B kann auch Protein-A-Sepharose-4B (Stephenson, F.a. et al . J. Neurochem. 46 (1986), S. 854-861) verwendet werden. Die Abtrennung der DA8-Rezeptoren vom DA8 erfolgt hierbei, wie zuvor beschrieben, durch den Dissoziationspuffer.
    [0055] Außerdem können die DA8-Rezeptoren mit dem Elutionspuffer A in Fraktionen zu 500 ul vom DA8 getrennt werden und mit gleichem Volumen des Neutralisationspuffers (pH 7.6) sofort neutralisiert werden. Die DA8-Rezeptoren können vom koeluierten Material entweder durch Dialyse (wenn DA8-Antikörper-Seρharose-4B verwendet wurde) oder durch
    [0056] Dialyse und anschließende Molekularexklusionschromatographie (wenn Schweine-Anti-Kaninchenimmunglobulin-Sepharose-4B verwendet wurde) getrennt werden.
    [0057] Die Inkubation mit DA8 kann auch bereits vor Herstellung von Zellmembranen oder vor der Solubilisierung der Zellmembranenerfolgen.
    [0058] Beispiel 4
    [0059] Isolierung und Darstellung von DA8 und DA8-Antikörpern Solubilisierte Zellmembranen, die nur das endogene rezeptorgebundene DA8 aufweisen, werden mit Sepharose-4B-verknüpften DA8-Antikörpern in Gegenwart eines Antikörperbindungspuffers (0.1M Natriumbicarbonat, pH 8.0, mit 0.5 M NaCl und 0.2 Vol.% Triton X-100) 16 Std. bei 4 Grad C inkubiert. Danach werden die DA8-Rezeptoren durch Inkubation mit dem Dissoziationspuffer (50mM TRIS-HCl , pH 7.6, mit 5 uM Schwei ne-DA8, 5 mM Mg2+, 5 mM EGTA und 5 uMol Gpp(NH)p) 30 min. bei 20 Grad C vom nativen DA8 getrennt.
    [0060] Der dadurch vorn endogenen DA8 abgelöste DA8 Rezeptor kann jetzt durch Dialyse oder Molekularexklusionschromatographie vom restlichen Material getrennt werden.
    [0061] Danach wird das endogene DA8 von den Sepharose-48-verknüpften DA8-Antikörpern durch den Elutionspuffer B abgelöst, in Fraktionen zu 500 ul gesammelt, sofort mit gleichem Volumen ciss Weutralisationspuffers neutralisiert und dureh Dialyse vom restlicnen Material getrennt.
    [0062] DA8-gebundene DA8-Rezeptoren können auch zuvor mit
    [0063] DA8 -Antikörper-enthaltendem Serum in zuvor üeschriebener Weise im Antikorperbindungspuffer inkubiert werden. Der Rezeμtor-natives DA8-Liganden-Antikörper-Komplex wird jetzt mit Schweine-Anti-Kaninchenimmunglobulin-Antikörper, die wie in Beispiel 1 beschreiben, mit aktivierter Sepharose-4B verknüpft werden, 16 Std. bei 4 Grad C inkubiert. Anstelle von Schweine-Anti-Kaninchenimmunglobulin-Antikörper-Sepharose-4B kann auch Protein A-Sepharose-4B verwendet werden. Die ungebundenen Serumbestandteile (z.B. nichtimmune Immunglobuline) werden dadurch von den DA8-gebundenen DA8-Antikörpern durch extensives Waschen entfernt. Die Abtrennung des DA-Rezeptors vom endogenen DA8 wird durch Inkubation mit dem Dissoziationspuffer wie zuvor durchgeführt. Der DA8-Rezeptor kann durch Dialyse vom restlichen Material getrennt werden. Das native DA8, das noch mit dem DA8-Antikörper verknüpft ist, kann jetzt, zusammen mit den DA8-Antikörpern von der Schwei ne-Anti-KaninchenimmunglobulinAntikörper verknüpften Sepharose-4B mit Elutionspuffer (0.1M Glycin-HCl, pH 2.5, mit 0.1 mMol PMSF und 0.2 Vol.% Triton X-100) abgelöst werden. Im Eluat befinden sich endogenes, ehemals rezeptorgebundenes DA8 und spezifische DA8-Antikörper. Durch nachfolgende Dialyse können die serumisolierten spezifischen DA8-Antikörper und durcn Molekularexklusionsehromatographie das native ehemals rezeptorgebuncene DA8 αargestellt werden.
    [0064] Außerdem kann das endogene DA8 durch Inkubation mit dem Elutionspuffer B (0.1 M Glycin-HCl , pH 2.5, mit 0.1 mMol PMSF und 0.2 Vo.% Triton X-100) von seinem DA8-Rezeptor und seinem DA8-Antikörρer getrennt, mit dem Neutralisationspuffer neutralisiert und durch Molekularexklusionschromatographie vom koeluierten Material getrennt werden. Durch Dialyse erhält man den DA8-Rezeptor, der bei Verwendung des Euutionspuffers A bioaktiv ist. Ehemals rezeptorgebundenes, endogenes DA8, DA8-Rezeptoren und DA8-Antikörper, die spezifisch für ehemals rezeptorgebundenes DA8 sind, wurden bisher noch nicht dargestellt. Sowohl das endogene DA8 als auch die DA8-Antikörper und die DA8-Rezeptoren gemäß der Erfindung weisen hohe Sensitivitäten und Soezifitäten auf.
    [0065] Beispiel 5
    [0066] Herstellung gereinigter DA8-Antikörper
    [0067] Solubilisierte DA8-Rezeptoren, die entsprechend der zuvor beschriebenen Weise (Beispiel 1) mit aktivierter Seρharose-4B verbunden wurden, werden mit dem Ligandbindungspuffer über 2 Std. bei 20 Grad C inkubiert. Danach werden die DA8-gebundenen DA8-Rezeptoren mit einem Serum, das im
    [0068] Antikörperbindungspuffer gelöst ist, inkubiert (16 Std. bei 4 Grad C) , das spezifische DA8-Antikörper enthält. Die spezifisch DA8-gebundenen DA8-Antikörper werden mit dem Elutionspuffer B (0.1M Glycin-HCl , pH 2.5 mit 0.1 Mol PMSF und 0.2 Vor% Triton X - 100) von DA8 abgelöst und sofort mit dem entsprechenden Neutralisationspuffer neutralisiert.
    [0069] Ggf. koeluiertes DA8 kann auf übliche Weise durch Dialyse von den DA8-Antikörpern getrennt werden. Die Inkubation mit synthetischem oder endogenem DA8 kann auch bereits vor der Herstellung der Zellmembranen oder vor der Solubilisierung von DA8-Rezeptoren erfolgen. Ferner kann DA8 an Stelle von solubilisierten DA8-Rezeptoren an Sepharose-4B-verknüpften, DA8-Rezeptortragende, nicht-solubilisierte biologische Materialien gebunden werden.
    [0070] DA8-Antikörper, die entsprechend dem hier dargestellten Verfahren gereinigt wurden, zeigen eine höhere Spezifität und Sensitivität zu synthetischem Schweine-DA8 als DA8-Antikörper, die in bisher üblicher Weise gereinigt wurden.
    [0071] Vor Durchführung der Verfahren zur Herstellung von Rezeptoren,
    [0072] DA8-Antikörpern und endogenem ehemals rezeptorgebundenem DA8 kann es notwendig sein, a) solches biologisches Material zu entfernen, das
    [0073] DA8-Material synthetisiert, transportiert oder lagert. Dies erfolgt durch Vorinkubation des biologischen Materials mit den Dissoziationspuffer (30 Min. bei 20 Grad C). Danach wird das biologische Material im Antikörperbindungspuffer gelost, mit DA8-Antikörper- verknüpfter Sepharose-4B für 16 Std. bei 4 Grad C inkubiert und aas ungebundene biologische Material wird curch Waschung entfernt. In der Waschlösung befindet sich das zur Reindarstellung von DA8-Antikörpern,
    [0074] DA8-Rezeptoren und endogenem ehemals rezeptorgebundenem DA8 verwendbare Material ; b) zuvor das endogene rezeptorgebundes DA8 von
    [0075] DA8-Rezeptor-tragenden, nicht solubilisierten Zellmembranen durch Inkubation mit dem Dissoziationspuffer von seinem Rezeptor zu trennen und danach durch Zentrifugation (2x30 min, 20.000 g, 4 Grad C) und Waschung oder durch Dialyse zu entfernen.
    [0076] Beispiel 7
    [0077] Chemische Kreuzvernetzung von DA8-Rezeptor mit DA8
    [0078] DA8-Rezeptor-DA8-Komplexe werden durch Inkubation (30 min. bei 20 Grad C) mit 50 ug/ml DSP (das in 0.01 M Phosphatpuffer, pH 8.0, mit 0.5 M NaCl , 5 mM Mg2+ und 0.1 Vol.% Triton-X-100 gelöst ist) kreuzvernetzt.
    [0079] Die Trennung der Kreuzvernetzung erfolgt nach Bindung des Dynorphi n-A(1-8)-Antikörpers durch Inkubation entweder mit 3 mM Dithiotreitol oder 5% Mercaptoethanol (beide gelöst in 0.01 M Phosphatpuffer mit 0.5 M NaCl , 5 mM Mg2+ und 0.1 Vol.% Triton X-100).
    权利要求:
    ClaimsP A T E N T A N S P R Ü C H E
    1. Verfahren zur Herstellung von reinen bioaktiven Rezeptoren gekennzeichnet durch a) Inkubation von solubilisierten ligandgebundenen Rezeptoren mit trägermaterial verknüpften Ligandenantikörpern (AK I) bspw. in einem
    Anti körperbi ndungspuffer; b) Inkubation des derart hergestellten immobilisierten Rezeptor-Ligand-Ligandenantikörper-Trägermaterial Komplexes in einer an sich bekannten Weise mit einem bspw. Ligandendissoziationspuffer unter Lösen der Rezeptor-Liganden-Bindung; c) Abtrennen des nicht immobilisierten freigesetzten Rezeptors in einer an sich bekannten Weise und d) ggf. Reinigung des dargestellten Rezeptors in einer an sich bekannten Wei se.
    2. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen bioaktiven Rezeptoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß a) der Rezeptor-Ligand-Ligandenantikörper-Komplex mit einem Trägermaterial inkubiert wird, an das Antikörper in einer an sich bekannten Weise gebunden sind, die spezifisch die Ligagdenantikörper binden (AK II); b) die Rezeptoren durch Inkubation in einer an sich bekannten Weise bspw. mit einem Ligandendissoziationspuffer gelöst werden; c) die Rezeptoren vom immobilisierten Ligand-Antikörper I-Antikörper II-Trägermaterial-Komplex in einer an sich bekannten Weise gelöst werden und d ) g g f . d er r e i n d a rg e s te l l te R e ze p tor i n a n s i c h bekannter Weise gereinigt wird.
    3. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen, bioaktiven Rezeptoren nach den Ansprüchen 1 und 2 dahingehend, daß an Stelle von AK II- verknüpftem Trägermaterial ein Trägermaterial verwendet wird, an das ein Stoff gebunden ist, der den AK I spezifisch bindet.
    4. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen, bioaktiven Rezeptoren nach den Ansprüchen 1, 2 und 3 dahingehend, daß a) die Ablösung der Rezeptoren von ihren Liganden bspw. in einer an sich bekannten Weise durch einen
    El utionspuffer erfolgt und daß b) die Rezeptoren ggf. in einer an sich bekannten Weise von den koeluierten Peptiden getrennt werden.
    5. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen, bioaktiven Rezeptoren nach den Ansprüchen 1 bis 4 dahingehend, daß die Bindung des Liganden entweder vor Herstellung der Zellmembranen oder vor Solubilisierung der Zellmembranen in einer an sich bekannten Weise erfolgt.
    6. Verfahren zur Herstellung von spezifischen, bioaktiven Dynorphi n-A(1-8)-Rezeptoren entsprechend den Ansprüchen 1 bis 5, gekennzeichnet durch die Verwendung von an sich bekannten Dynorphin-A(1-8)-Antikörpern und
    Dynorphi n-A(1-8) als Liganden.
    7. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 5 hergestellten Rezeptoren zur a) Herstellung von poly- oder monoklonalen Rezeptorantikörpern einschließlich deren Verwendung zur
    (1) Isolierung und Identifizierung von Rezeptor-cDNA-Klonen,
    (2) Unterscheidung von normalem oder pathologisch verändertem biologischem Material unter Einsatz von chemischen oder immunhistochemischer Verfahren,
    (3) Isolierung und Charakterisierung von spezifischen Rezeptor- und/oder Ligandenbindungsstellen einschließlich der Herstellung und Verwendung von poly- und/oder monoklonalen Antikörpern gegen diese Liganden- und/oder Rezeptorbindungsstellen,
    (4) Entwicklung von Testsystemen zur Aufklärung von Wirkungsmechanismen synthetischer und/oder natürlicher Wirkstoffe und deren Derivate,
    (5) Isolierung spezifischer Zellpopulationen aus einem heterogenen Zellgemisch; b) und als Arzneimittel einschließlich von poly- und/oder monoklonalen Rezeptorantikörpern sowie Antikörpern, die gegen spezifische Ligand- und/oder Rezeptorbindungsstellen gerichtet sind; c) sowie zur Isolierung von Rezeptor-cDNA-Klonen aus einem Klongemisch durch spzifische Bindung eines spezifischen Ligand-AK I-Trägermaterial-Komplexes entsprechend den Ansprüchen aus 1 bis 5 an ein Klon ( Klon-Ligand-AK
    I-Trägermaterial-Komplex).
    8. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 5 hergestellten reinen, bioaktiven Dynorphin-A(1-8)-Rezeptoren entsprechend den in Anspruch 7 aufgelisteten Verwendungsansprüchen.
    9. Verfahren zur Herstellung von nativen, ehemals rezeptorgebundenen bioaktiven Liganden durch Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen bioaktiven Rezeptoren nach den Ansprüchen 1 bis 5 dahingehend, daß a) Zellmembranen, die nur den nativen rezeptorgebundenen Liganden aufweisen, mit Trägermateri al- verknüpften AK I inkubiert werden und b) der Rezeptor bspw. durch Inkubation in einer an sich bekannten Weise mit einem Ligandendissoziationspuffer und anschließender Reinigung vom restlichen immobilisierten Material entfernt wird, oder c) der Ligand ospw. in einer an sich bekannten Weise durch Elution vom Rezeptor gelöst wird und d) durch in an sich bekannter Weise gereinigt wird.
    10. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von nativen, ehemals rezeptorgebundenen Liganden dahingehend, daß a) der native, rezeptorgebundene Ligand in einer an sich bekannten Weise mit einem Serum inkubiert wird, das den
    AK I enthält und daß b) dieser Rezeptor-Ligand-AK I-Komplex mit einem AK
    I-verknüpften Antikörperbindungspuffer inkubiert wird, c) der Rezeptor bspw. durch Inkubation in einer an sich bekannten Weise mit einem Ligandendissoziationspuffer von dem nativen Liganden abgelöst wird und ggf. in an sich bekannter Weise entfernt wird, oder d) daß in einer an sich bekannten Weise der Rezeptor, zusammen mit dem nativen Liganden und den Antikörpern I, bspw. durch Elution abgelöst wird und e) der native Ligand ggf. in einer an sich bekannten Weise gereinigt wird.
    11. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von nativen, ehemals rezeptorgebundenen Liganden entsprechend dem Anspruch 10, dahingehend, daß an Stelle von AK
    II-Trägermaterial ein Trägermaterial verwendet wird, an das ein Stoff gebunden ist, der den AK 1 spezifisch bindet.
    12. Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von nativen, ehemals rezeptorgebundenen Liganden und Rezeptoren entsprechend den Ansprüchen 9 und 10 dahingehend, daß a) zur Reindarstellung von bioaktiven Rezeptoren der Rezeptor vom nativen Liganden bspw. in einer an sich bekannten Weise durch einen Ligandendissoziationspuffer gelöst wird und nachfolgend b) der native Ligand und der AK I vom immobilisierten AK II bspw. in an sich bekannter Weise durch Elution getrennt wird, und c) ggf. der Rezeptor und Ligand in an sich bekannter Weise gereinigt werden.
    13. Verfahren zur Herstellung von reinen und bioaktiven Dynorphi n-A(1-8)-Rezeptoren entsprechend der Ansprüche aus 9 bis 12, gekennzeichnet durch die Verwendung von an sich bekannten Dynorphi n-A(1-8)-Antikörpern.
    14. Verwendung der nach den Ansprüchen 9 bis 12 hergestellten bioaktiven nativen Liganden und bioaktiven Rezeptoren entsprechend den Verwendungsansprüchen des Anspruchs 7.
    15. Verwendung der nach den Ansprüchen 9 bis 12 hergestellten nativen, ehemals rezeptorgebundenen, bioaktiven Dynorphin-A(1-8), Dynorphin-A(1-8)-Rezeptoren und Dynorphin-A(1-8)-Antikörpern entsprechend den Verwendungsansprüchen des Anspruchs 7 .
    16. Verfahren zur Herstellung von gereinigten AK I durch Abänderung des Verfahrens zur Herstellung von reinen bioaktiven Rezeptoren nach den Ansprüchen 1 bis 5 dahingehend, daß a) Trägermateri al-verknüpfte Rezeptoren mit ihrem Liganden in einer an sich bekannten Weise verbunden werden und b) dieser Trägermateri al-Rezeptor-Ligand-Komplex mit einem AK I-enthaltenden Serum in einer an sich bekannten Weise inkubiert wird und c) die AK I zusammen mit dem Liganden in einer an sich bekannten Weise eluiert werden und d) die AK I in einer an sich bekannten Weise von den koeluierten Liganden getrennt werden.
    17. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Dynorphin-A(1-8)-Antikörpern entsprechend dem Anspruch 16 durch Verwendung von Dynorphi n-A(1-8) und solchen Dynorphin-A(1-8)-Rezeptoren, die entsprechend den Ansprüchen 1 bis 5 und 9 bis 13 hergestellt wurden.
    18. Verwendung der nach dem Anspruch 16 hergestellten gereinigten Ligandantikörpern entsprechend der Verwendungsansprüche aus Anspruch 7 einschließlich der Isolierung und Charakterisierung von Ligand-cDNA-Klonen.
    19. Verwendung der nacn dem Anspruch 16 hergestellten gereinigten Dynorphin-A(1-8)-Antikörpern entsprechend den Verwendungsansprüchen aus Anspruch 7 einschließlich der Isolierung und Charakterisierung von
    Dynorphin-A(1-8)-cDNA-Klonen.
    20. Verfahren zur Herstellung reiner bioaktiver Rezeptoren,
    Liganden oder Ligandenantikörpern nach einem der vorgenannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die
    Rezeptor-Liganden-Komplexe in einer an sich bekannten Weise chemisch verbunden werden.
    21. Verfahren zur Herstellung reiner bioaktiver Rezeptoren, Liganden oder Ligandenantikörpern nach einem der vorgenannten Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Bindung entsprechend dem Anspruch 20 nach Bildung des Rezeptor-Ligand-Ligandenantikörper-Trägermaterial-Kornplexes entsprechend einem der vorgenannten Ansprüche in einer an sich bekannten Weise wieder gelöst wird.
    22. Abänderung der Ansprüche 1 bis 6, 9 bis 13 und 16 bis 17 dahingehend, daß das biologische Material - das den Liganden synthetisiert, transportiert oder lagert - in einer an sich bekannten Weise durch Inkubation mit AK
    I-verbundenem Trägermaterial aus dem biologischen Material gemi seh entfernt wird.
    23. Abänderung der Verfahren 1 bis 6, 9 bis 13 und 16 bis 17 dahingehend, daß das biologische Material - das Dynorphin-A(1-8) synthetisiert, transportiert oder lagert - in einer an sich bekannten Weise durch Inkubation mit Dynorphin-A(1-8)-Antikörper-verknüpftem Trägermateri al aus dem biologischen Materialgemisch entfernt wird.
    24. Abänderung der Ansprüche 1 bis 6, 9 bis 13 und 16 bis 17 dahingehend, daß der native, rezeptorgebundene Ligand zuvor bspw. in einer an sich bekannten Weise mit einem Ligandendissoziationspuffer oder einem Elutionspuffer von seinem Rezeptor abgelöst wird.
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    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1987-03-12| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1987-03-12| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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